Die Hypermethylierung des Promotors ist ein häufiger Mechanismus der Transkriptionsrepression von Genen bei Krebs und wird als typisches krebsspezifisches Merkmal angesehen. Die Untersuchung der DNA-Methylierung ist ein vielversprechendes Hilfsmittel zur Krebsfrüherkennung, Risikoabschätzung und zur Untersuchung des Ansprechens auf eine Behandlung. In einer aktuellen Studie (1) wurde die Promotormethylierung in formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebeproben (FFPE-Gewebe) mittels quantitativer, hochauflösender Schmelzkurvenanalyse (HRM, engl. highresolution melt) mit dem LightCycler® Instrument von Roche (SIX: RO, ROG; OTCQX: RHHBY) untersucht. Da das meiste Probenmaterial aus gesunden Kontrollen und erkrankten Geweben in Form von FFPE-Gewebeproben vorliegt, ist es von unschätzbarem Wert für die Forschung, wenn dieser Probentyp verwendet werden kann. Methodische Tests sind äußerst wichtig, um Robustheit und Empfindlichkeit eines Assays zu zeigen; er kann dadurch als Forschungswerkzeug etabliert und möglicherweise später in der Routinediagnostik eingesetzt werden.
Die Forschungsstudie wurde mit dem Ziel durchgeführt, HRM-Assays zum Nachweis der Promotormethylierung in archivierten FFPE-Gewebeproben von Personen mit Dickdarmkrebs zu etablieren. Als Machbarkeitsnachweis zeigten die Forscher die Anwendbarkeit der HRM-Analyse zum Nachweis der Promotormethylierung an den Promotoren der Gene MGMT (O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase), APC ("adenomatous polyposis coli"), GSTP1 (Glutathion-S-Transferase P1) und PTEN ("phosphatase and tension homolog deleted on chromosome 10") in einer mit komplett methylierter DNA hergestellten Verdünnungsreihe. In einem zweiten Schritt wurden die HRM-Assays für MGMT und APC an DNA getestet, die aus frischen oder FFPEfixierten menschlichen Krebszelllinien isoliert worden war. Die etablierten HRM-Assays für MGMT und APC wurden dann an archivierten FFPE-Dickdarmtumorproben für Forschungszwecke getestet. Methylierte DNA konnte reproduzierbar bis zu einem Anteil von nur 1 % vor einem Hintergrund aus unmethylierter DNA nachgewiesen werden. Für manche Anwendungen, beispielsweise zum Nachweis seltener Ereignisse oder zur Risikostratifizierung von Individuen auf Grundlage des Methylierungsstatus spezifischer Marker, ist eine hohe Empfindlichkeit des Assays wichtig. Dieser empfindliche Assay kann für den Nachweis weniger methylierter Zellen in einem Tumor angepasst werden und sogar für den Nachweis weniger Tumorzellen vor einem Hintergrund aus normalen Zellen in Lymphknoten und anderen Organen.
Die beliebtesten Techniken zum Nachweis der Methylierung der DNA basieren auf der Behandlung genomischer DNA mit Natriumbisulfit. Hierdurch wird Cytosin in Uracil umgewandelt, während 5 Methylcytosin unverändert bleibt. Der hierdurch entstehende Sequenzunterschied kann genutzt werden, um die Methylcytosine in einer anschließenden PCR-Reaktion zu identifizieren. Die genauesten Methylierungsprofile werden mit der Bisulfit-Sequenzierung erhalten, die einzelne Methylcytosine identifizieren kann. Es wurden jedoch auch verschiedene einfachere PCR-Methoden entwickelt, die besonders für kleinere Forschungslabore geeignet sind. Eine dieser neueren und einfacheren Methoden ist die hochauflösende Schmelzkurvenanalyse (HRM-Analyse), die auf den "Schmelzeigenschaften" der DNA in Lösung beruht. Mit Bisulfit behandelte DNA-Moleküle mit unterschiedlichem Methylcytosingehalt besitzen unterschiedliche Schmelztemperaturen und können so in einer Schmelzkurvenanalyse unterschieden werden. Die HRM-Analyse ist eine vergleichsweise einfache und kostengünstige Methode, da keine teuren Sonden benötigt werden und keine Referenzgene zur Normalisierung untersucht werden müssen. Zudem werden mit der HRM-Technik alle CpG-Dinukleotide des Amplikons analysiert, so dass der Assay anhand der Form der Schmelzkurve vollständige von partieller Methylierung unterscheiden kann. Dies kann wichtig sein, da die CpG-Inseln in Promotorregionen meist nicht gleichmäßig methyliert sind.
(1) Roche Applied Science Cancer Research Application Note No. 3: M. Malic, M. Pichler, E. Heitzer, J. Strutz, N. Dandachi (2009). High quality assessment of DNA methylation in archival tissues from patients with colorectal cancer using quantitative highresolution melting analysis, www.cancer-research.roche.com.
Die Forschungsstudie wurde mit dem Ziel durchgeführt, HRM-Assays zum Nachweis der Promotormethylierung in archivierten FFPE-Gewebeproben von Personen mit Dickdarmkrebs zu etablieren. Als Machbarkeitsnachweis zeigten die Forscher die Anwendbarkeit der HRM-Analyse zum Nachweis der Promotormethylierung an den Promotoren der Gene MGMT (O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase), APC ("adenomatous polyposis coli"), GSTP1 (Glutathion-S-Transferase P1) und PTEN ("phosphatase and tension homolog deleted on chromosome 10") in einer mit komplett methylierter DNA hergestellten Verdünnungsreihe. In einem zweiten Schritt wurden die HRM-Assays für MGMT und APC an DNA getestet, die aus frischen oder FFPEfixierten menschlichen Krebszelllinien isoliert worden war. Die etablierten HRM-Assays für MGMT und APC wurden dann an archivierten FFPE-Dickdarmtumorproben für Forschungszwecke getestet. Methylierte DNA konnte reproduzierbar bis zu einem Anteil von nur 1 % vor einem Hintergrund aus unmethylierter DNA nachgewiesen werden. Für manche Anwendungen, beispielsweise zum Nachweis seltener Ereignisse oder zur Risikostratifizierung von Individuen auf Grundlage des Methylierungsstatus spezifischer Marker, ist eine hohe Empfindlichkeit des Assays wichtig. Dieser empfindliche Assay kann für den Nachweis weniger methylierter Zellen in einem Tumor angepasst werden und sogar für den Nachweis weniger Tumorzellen vor einem Hintergrund aus normalen Zellen in Lymphknoten und anderen Organen.
Die beliebtesten Techniken zum Nachweis der Methylierung der DNA basieren auf der Behandlung genomischer DNA mit Natriumbisulfit. Hierdurch wird Cytosin in Uracil umgewandelt, während 5 Methylcytosin unverändert bleibt. Der hierdurch entstehende Sequenzunterschied kann genutzt werden, um die Methylcytosine in einer anschließenden PCR-Reaktion zu identifizieren. Die genauesten Methylierungsprofile werden mit der Bisulfit-Sequenzierung erhalten, die einzelne Methylcytosine identifizieren kann. Es wurden jedoch auch verschiedene einfachere PCR-Methoden entwickelt, die besonders für kleinere Forschungslabore geeignet sind. Eine dieser neueren und einfacheren Methoden ist die hochauflösende Schmelzkurvenanalyse (HRM-Analyse), die auf den "Schmelzeigenschaften" der DNA in Lösung beruht. Mit Bisulfit behandelte DNA-Moleküle mit unterschiedlichem Methylcytosingehalt besitzen unterschiedliche Schmelztemperaturen und können so in einer Schmelzkurvenanalyse unterschieden werden. Die HRM-Analyse ist eine vergleichsweise einfache und kostengünstige Methode, da keine teuren Sonden benötigt werden und keine Referenzgene zur Normalisierung untersucht werden müssen. Zudem werden mit der HRM-Technik alle CpG-Dinukleotide des Amplikons analysiert, so dass der Assay anhand der Form der Schmelzkurve vollständige von partieller Methylierung unterscheiden kann. Dies kann wichtig sein, da die CpG-Inseln in Promotorregionen meist nicht gleichmäßig methyliert sind.
(1) Roche Applied Science Cancer Research Application Note No. 3: M. Malic, M. Pichler, E. Heitzer, J. Strutz, N. Dandachi (2009). High quality assessment of DNA methylation in archival tissues from patients with colorectal cancer using quantitative highresolution melting analysis, www.cancer-research.roche.com.
